
Стерилизация газовой плазмой: относительная эффективность фазы стерилизации пероксидом водорода по сравнению с плазменной фазой*РезюмеПоследние изменения, внесенные в третью редакцию сборника «Европейская фармакопея» (European Pharmacopeia) (1 января, 1997 г.), послужили поводом к анализу чувствительности штамма Bacillus stearothermophilus АТСС 7953, споры которого на сегодняшний день используются для контроля эффективности стерилизации пероксидом водорода вместо спор Bacillus subtilis var niger АТСС 9372. Исследование кинетики инактивации подтвердило обоснованность данного выбора, а также показало, что технология стерилизации газовой плазмой STERRAD® 100 более эффективна по сравнению с другими благодаря использованию пероксида водорода. Ионизация в плазменной фазе, в свою очередь, в процессе детоксикации, как было признано, не дает какого-либо спорицидного эффекта. |
I. Введение
STERRAD® 100 – технология низкотемпературной стерилизации газовой плазмой с использованием плазмы пероксида водорода – впервые была представлена несколько лет назад (Addy, 1991; Holler et al 1993) и была успешно продавалась в ряде Европейских стран, Японии и США. Благодаря этой надежной и простой в применении технологии медицинские учреждения получили возможность использовать метод стерилизации, чья эффективность признана по всему миру, а также новую аппаратуру. У этой системы есть три основных преимущества: (1) возможность стерилизации чувствительных к температурным воздействиям инструментов; (2) отсутствие токсичных отходов и (3) относительно короткий цикл стерилизации. Стерильные инструменты готовы к использованию примерно через час, при этом проводить десобрцию газа из инструментов не требуется.
Было опубликовано несколько работ на тему бактерицидного
механизма данных процедур. Авторы отдельных работ придерживались
противоположных мнений, а некоторые вообще не признавали метод как процесс
стерилизации.
В спецификации, недавно добавленной в сборник «Европейская фармакопея», 1997 г., предписывается использовать в качестве биологического индикатора для стерилизации пероксидом водорода штамма Bacillus subtilis var niger ATCC 7953. Этот документ привел нас к мысли о целесообразности исследований устойчивости спор других штаммов, рекомендованных в качестве биологических индикаторов в других официальных источниках (Bacillus subtilis var niger ATCC 9372 для стерилизации сухим жаром и оксидом этилена и Bacillus pumilus ATCC 27142 для стерилизации иррадиацией). Нам также хотелось определить относительный вклад пероксида водорода и ионизации за счет электромагнитного поля в эффективность плазменного метода.
2. Методы
2.1 Стерилизатор
Для испытаний был взят аппарат STERRAD* 100, предоставленный компанией Johnson and Johnson Medical SA (Франция) и произведенный ASP Inc. (Irvine. CA, США). Расчетный цикл (рис. 1) для данного типа аппаратуры состоит (в режиме глубокого вакуума) из фазы диффузии пероксида водорода в камеру объемом 175 л (дозировка по 1810 мг с содержанием пероксида водорода 58%) для достижения итоговой концентрации прирмерно в 6 мсек/л, последующей плазменной фазы продолжительностью 15 мин (300 В) с использованием генератора электромагнитных волн (13,56 МГц, 10 эВ). Температура камеры - 45 ± 2°C. Для изучения эффектов на сублетальных дозах мы использовали кассеты с более низким содержанием пероксида водорода (таблица 1), а также специально разработанное программное обеспечение, позволяющее изменять продолжительность фазы стерилизации. Все фазы стерилизации были реализованы в лабораториях Johnson and Johnson Medical France в Шатне-Малабри под наблюдением руководящего персонала компании.
2.2. Подготовка биологических индикаторов
Мы использовали споры трех штаммов, описанных в сборнике «Европейская фармакопея» (1997 г.): B. stearothermophilus ATCC 7953, B. subtilis var niger ATCC 9372, В. pumilus ATCC 27142.
Таблица 1
Вес и концентрация гидроксида водорода для ввода, и итоговые концентрации в камере во время экспериментов
| Типы | Общий вес* (мг/лунку) |
Пероксид водорода (% лунки) |
Итоговая концентрация в камере (мг*л) |
| Полный цикл |
1810 |
58 |
6 |
| Т |
1788 |
0 (вода) |
0 |
| А |
330 |
2.90 |
0.09 |
| В |
1260 |
2.48 |
0.18 |
| С |
2180 |
2.92 |
0.36 |
Споры были получены путем выращивания бактерий в специальной среде (3 г триптона / 2,5 г дрожжевого экстракта / 0,05 г MnSO4 / 0,10 г CaCl2 / 500 мл дистиллированной воды /pH в пределах 6,8-7,2). По окончании инкубационного периода в 20 дней при температуре 370C для B. pumilus ATCC 27142 и B. subtilis ATCC 9372 и 450C для B. stearothermophilus ATCC 7953, культуры несколько раз центрифугировались и отстаивались, после чего каждый отстой собирался, помещался в эмульсию (чистый этанол) и хранился в течение недели при температуре + 40C. Споры, которые можно было восстановить, были подсчитаны с помощью посева на соответствующих растворах, и были пересмотрены характеристики каждого штамма (API 50CH, API 20 E). Затем суспензии (50 моль*л) были нанесены на три наиболее распространенных типа носителя для стерилизации: бумажные полоски (ур. 740 E, Schleicher and Schueil) в соответствии с предписаниями Фармакопеи, полиэтиленовые полоски (Tyvek®), рекомендованные производителем системы STERRAD®, (ASP), и полиэтиленовые трубки (стандартный тип носителя для гемолиза). Полиэтиленовые трубки использовались в данном опыте для сравнения полной гидрофобной поверхности с полосками. После сушки (48 ч при температуре 300C) споры, которые можно было восстановить, были подсчитаны на 20 полосках или трубках по указанной выше технологии (No.), а остальные – упакованы перед стерилизацией в пакеты с пластиковой и полиэтиленовой (Tyvek®) сторонами (по TX 76004.0130, ASP).
2.3. Наблюдение за выжившими спорами
После подготовки биологических индикаторов, или после использования, мы подсчитали число колониеобразующих единиц на каждом носителе (КОЕ/носитель) следующим образом:
2.3.1. Анализ полосок (на кривые выживаемости)
Каждая полоска была помещена в лубрикант, содержащий 5 мл триптон-соевого бульона и 5 г стерильных стеклянных шариков (бус). Затем трубки подвергались воздействию ультразвука (Sonoclean, Bandei in electronic RK, 102 H) в течение 3 мин, после чего их содержимое механически перемешивалось (Vertex *).
Полученная таким образом суспензия была разбавлена от 10-1 до 10-4 (водным раствором пептона, 2 г/л в солевом растворе) и подсчитана посевом на соево-казеиновый агар с инкубационным периодом в 72 ч при температуре 370C для B. subtilis var niger ATCC 9372 и B. pumilus ATCC 27142 или 450C для B. stearothermophilus ATCC 7953, как описано в «Европейской фармакопее» (1997 г.).
2.3.2. Анализ трубок (на кривые выживаемости)
Мы добавили в каждую трубку по 5 мл бульон, затем подвергли трубки ультразвуковому воздействию в течение 3 мин., после чего каждая суспензия была использована так же, как и при анализе для полосок.
2.3.3. Анализ полосок и трубок (на негативную фракцию)
Для определения негативной фракции (Caputo ei al., 1979), мы провели тест на стерильность с использованием триптон-соевого бульона и инкубационным периодом в 7 дней(6 мг на 1 цикл).
3. Результаты
3.1 Определение концентрации и времени диффузии пероксида водорода
Изучение кинетики плазменной фазы невозможно при использовании стандартных концентраций (6 мг/л). В связи с этим мы сначала определили диффузионные параметры пероксида водорода (концентрацию и время диффузии) в течение первоначальной фазы цикла с целью подбора экспериментальных условий, которые позволили бы сохранить жизнеспособность как минимум 105 спор в каждом носителе, а также обеспечили бы возможность исследования кинетики плазменной фазы: На рисунке 2 представлены результаты, полученные путем инактивации трех штаммов Бацилл со временем диффузии составившим 30 минут. На рисунке 3 показана кинетика инактивации наиболее устойчивых штаммов (В. stearothermophilus, ATCC [Американская коллекция типовых культур] 7953), кроме того, в Таблице 2 представлены значения времени десятичного уменьшения (значения D), которые характеризуют длительность воздействия, которое делает возможным уменьшение концентрации каждого типа биологического маркера за одну логарифмическую единицу исключительно за счет пероксида водорода. Объединенные результаты подтверждают, что пероксид водорода в цикле STERRAD* 100 обладает мощным спороцидным воздействием (Родовски/Rodovski с соавт., 1996) и обеспечивает продолжительный кинетический профиль дозы-эффективности. B. pumilus ATCC 27142 проявила резистентность, практически аналогичную В. stearothermophilus ATCC 7953, и не отмечено влияния носителей на результаты. Для последующих этапов нашего исследования мы отобрали кассеты типа С для финальной концентрации в камере 0,36 мг/л пероксида водорода и время диффузии 30 минут.
Рисунок 2. Инактивация спор в низкой концентрации пероксида водорода (45°С). Ордината: логарифм UFC[очистка восходящим потоком]/носитель (π = 5), абсцисса: концентрация Н2О2 в камере. n Вacillus stearothermophilus ATCC 7953, l Bacillus pumilus ATCC 27142, p Bacillus subtilis ATCC 9372.
Рисунок 3. Инактивация Вacillus stearothermophilus ATCC 7953 (45°С) пероксидом водорода. Ордината: логарифм UFC/носитель (n = 10 - 30), абсцисса: экспозиция. 0,36 мг/л пероксида водорода в камере; введение в камеру 1.730 мг воды (контроль).
3.2 Исследования плазменной фазы
На рисунке 4 показана кинетика инактивации, наблюдаемая в трех штаммах Бацилл в плазменной фазе
Таблица 2
Определение D значений в различных типах спор или носителей
| Виды микроорганизмов | Носители |
Пероксид водорода (мг/л) |
Среднее D значение (мин) |
Диапазон D значений (мин) |
| Вacillus stearothermophilus ATCC 7953 | Бумага (полоски) |
0 |
>50 |
- |
| 0.09 |
>50 |
- |
||
| 0.18 |
20 | 16-28 | ||
| 0.36 |
10 |
8-14 |
||
| 6 |
5 |
3.4-7 |
||
| Полиэтилен (полоски) |
0 |
>30 |
- |
|
| 0.09 |
>50 |
- |
||
| 0.18 |
16 |
2-24 |
||
| 0.36 |
9 |
8-14 |
||
| 6 |
5 |
4-6.2 |
||
| Bacillus pumilus ATCC 27142 | Бумага (полоски) |
0 |
>30 |
- |
| 0.36 |
10 |
8-13.2 |
||
| 6 |
4 |
3.1-5.1 |
||
| Полиэтилен (трубки) |
0 |
>50 |
- |
|
| 0.09 |
>50 |
- |
||
| 0.18 |
22 |
15-25 |
||
| 0.36 |
10 |
8-13 |
||
| 6 | 4 |
3.2-6 |
||
| Bacillus subtilis var. niger. ATCC 9372 | Бумага (полоски) |
0 |
>50 |
- |
| 0.36 |
3.9 |
24.5 |
||
| 6 |
2 |
- |
||
| Полиэтилен (полоски) |
0 |
>50 |
- |
|
| 0.36 |
10 |
8.13 |
||
| 6 |
2.4 |
2-3.2 |
Для определения D значений анализировались данные микробной деструкции в зависимости от кривой выживания методом прямого перебора, за исключением цикла 6 мг/л (методики негативной фракции, восходящие к методике Спермана-Курбе/Spearman-Kurbet).
Мы не исследовали кинетический профиль времени-эффекта. Незначительное повышение выживаемости спор, наблюдаемое у В. stearothermophilus, ATCС 7953, может быть индуцировано механическим или термическим воздействием электромагнитных лучей.
4. Дискуссия
Наши данные четко демонстрируют, что В. stearothermophilus, ATCС 7953 и B. pumilus ATCC 27142 являются наиболее устойчивыми микроорганизмами в условиях стерилизации методом STERRAD* 100.
Споры В. stearothermophilus, ATCС 7953 на бумажных полосках представляют собой оптимальный биологический индикатор при стерилизации пероксидом водорода, подтверждая рекомендации Европейской Фармакопеи (1997). Также может рекомедоваться использование B. pumilus ATCC 27142. Ряд авторов (Мекке/Mecke, 1992; Гейсс/Geiss с соавт. 1994; Бьялашевич/Bialasiewicz с соавт., 1995) утвердили использование данного микроорганизма в связи с наличием коммерческих препаратов: он представляет собой биологический индикатор для мониторинга стерилизации ионизирующей радиацией, и содержит более высокие концентрации спор (107-108), по сравнению с коммерческими препаратами В. stearothermophilus (105-106).
Рисунок 4. Эффект электромагнитной активации («плазмы») после частичной инактивации пероксидом водорода (30 минут, 0.36 мг/л в камере). Ордината: логарифм UFC/носитель (n = 10 - 30), абсцисса: экспозиция. Вacillus stearothermophilus ATCC 7953, Bacillus pumilus ATCC 27142, Bacillus subtilis ATCC 9372.
Использование Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372, тем не менее, не рекомендуется, в связи с его большей чувствительностью и значительно большей вариабельностью получаемых результатов. Этот микроорганизм рекомендуется для паровой фазы стерилизации пероксидом водорода (Риклов/Rickloff и Грахам/Graham, 1989), которая, насколько нам известно, исключена в связи с низкими эксплуатационными характеристиками.
Плазменная фаза STERRAD* 100, по-видимому, не является спороцидной, во всех случаях в наших условиях исследования, вне зависимости от экспозиции, видов микроорганизмов или носителей. Это новые данные, поскольку для оценки данного типа стерилизации в литературе были описаны только полные циклы (Нельсон/Nelson и Бергер/Berger, 1989; Мекке/Mecke, 1992; Гейсс/Geiss с соавт. 1994; Кий/Kyi с соавт. 1995; Питерс/Peeters и Борчерс/Borchers, 1995; Альфа/Alfa с соавт., 1996), фрации разделенного цикла с использованием соотношения фазы диффузии пероксида водорода и плазменной фазы, пропорционального (Адди/Addy, 1991; Борнев/Borneff с соавт., 1995) или различны диффузионные фазы с последующей плазменной фазой длительностью 15 минут (Якобс/Jacobs и Цу Мин Лин/Szu Min Lin, 1996). После тщательного исследования кинетики инактивации, как продемонстрировано на Рис. 3 совместно с Рис. 4, можно отметить, что этот процесс включает в себя несколько этапов. В течение 30-минутной диффузионной фазы, крутизна кривой уменьшается, отражая снижение эффективности со временем, наиболее вероятно вследствие связывания или потребления газа. Затем, спороцидное действие внезапно прекращается непосредственно в начале плазменной фазы, и это может объясняться деструкцией молекулярной формы пероксида водорода. Однако это наблюдение не предполагает, что плазменная фаза в полном цикле имеет меньшее значения: она способствует разрушению пероксидных радикалов и всех токсичных остатков, которые могут загрязнять стерилизуемые медицинские приборы.
Стерилизация с использованием пероксида водорода и ионизирующих методик (STERRAD* 100 газ-плазма) является эффективным и безопасным процессом, который получает все большее и большее распространение на протяжении последних 5 лет. Мы продемонстрировали, что стерилизующий эффект обусловлен пероксидом водорода, тогда как ионизирующий процесс в плазменную фазу играет прежде всего детоксикационную роль. Это наблюдение делает возможным мониторинг эффективности стерилизационных циклов с применением более четко определенных биологических индикаторов. Этот новый кинетический подход должен способствовать оптимизации этого процесса, а также исследованию новых применений.
Ссылки
Адди Т./Addy T., 1991 Новая методика стерилизации для стерилизации медицинских изделий в условиях стационара. Из Материалов Международной Килмеровской Мемориальной Конференции по попросам стерилизиции медицинских изделий. Polyscience, Morin Heights, Канада, стр. 80-95.
Альфа М.Дж./Alfa M.J., 1996 Плазменная стерилизация. Испытание узкими отверстиями. Infect. Control. Steril. Technol. 2, 18-22.
Альфа М.Дж./Alfa M.J., Дегагне П./Degagne P., Ольсон Н./Olson N., Пучалски Т./Puchalski T., 1996 Сравнение стерилизаторов с использованием ионной плазмы, парообразного пероксида водорода и 100% оксида этилена и <неразб> газового стерилизатора с использованием оксида этилена. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 92-100
Бьялашевич А.А./Bialasiewicz А.А., Форч М./Förtsch, Самман А./Sammann A., Дмегер Дж./Dmeger J., 1995 Плазменная стерилизация отдельных офтальмологических инструментов для комбинированного интраокулярного хирургического вмешательства. Ophthalmic Res. 27, 124-127.
Борнев М./Borneff M., Рупперт Дж./RUppert J., Окпара Дж./Okpara J., Бах А./Bach A., Маношон П./Manoshon P., Амрайн П./Amreihn P., Зоннтаг Х.Г./Sonntag H.G., 1995. Исследование эффективности стерилизации низкотемпературной плазмой (НТП) с использование тестовых объектов, симулирующих практические условия. Zentr Steril. 3, 361-371
Капуто Р.А,/Caputo R.A., Одланг Т.Е./Odlang T.E., Вилкинсон Р.Л./Wilkinson R.L., Масколи С.С./Mascoli C.C., 1979 Биологическая оценка процесса стерилизации при использовании J. Parenter. Drug. Assoc. 22, 214-221
Дарборд Дж.С.,/Darbord J.C. 1996 Оценка метода стерилизации с использованием газовой плазмы. Revue de I’ADPHSO 21, 101-105
Европейская фармакопея, 1997 3 издание, Секретариат Европейской фармакопеи. Страсбург, стр. 205-206
Гейсс Х.К./Geiss H.K., Хейд Х./Heid H., Хирт Р./Hirth R., Зоннтаг Х.Г./Sonntag H.G., 1994 Плазменная стерилизация. Альтернативный низкотемпературный метод стерилизации. Zentr.Steril. 2, 263-269
Холер К./Holler C., Мартини Х./Martiny H., Кристиансен Б./Christiansen B., Руден Х./Ruden H., Гундерман К.О./Gunderman K.O., 1993 Эффективность низкотемпературной плазменной стерилизации, новой стерилизационной методики. Zbl. Hyg. 194, 380-391
Якобс П.Т./Jakobs P.T., Цу Мин Лин/Szu Min LIn, 1996 Газо-плазменная стерилизация. В: Распространение полимеров, теоретические основы и Технологические применения. Американское общество химиков, Вашингтон, стр. 216-239
Кий М.С./Kyi M.S., Холтон Дж./Holton J., Риджвей Г.Л./Ridgway G.L., 1995 Оценка эффективности низкотемпературной газо-плазменной стерилизационной системы. J. Hosp. Infect. 31, 275-284
Ландхольм М./Landholm M., Нистрем Б./Nyström B., 1994 Оценка низкотемпературных стерлизаторов. Zentr. Steril. 2, 370-374
Мекке П./Mecke P. 1992 Пероксид-водородная плазма: интересная микробиологическая концепция. Hyg. Med 17, 337-543
Нельсон К.Л./Nelson C.L., Бергер Т.Дж./Berger T.J., 1989 Инактивация микроорганизмов кислородной газовой плазмой. Current Microbiol, 18, 275-276
Питерс Дж./Peeters J., Борхерс У./Borchers U., 1995 Сравнительные исследования резистентности cпор Mycobacterium terrae, Aspergillus niger и Бацилл в процессе плазменной стерилизации. Zentr. Steril. 2, 163-172
Риклов Дж.Р./Rickloff J.R., Грехам Г.С./Graham G.S., 1989 Стерилизация пероксидом водорода в паровой фазе. J. Healthcare Mater, Management, 47-49
Роговски Г./Rogovski G., Богомолов В./Bogomolov V., Иванов M./Ivanov M., Рунавот Дж./Runavot J., Дебус А./Debus A., Викторов А./Victorov A., Дарборд Дж.С./Darbord J.C., 1996 Программа планетарной защиты для миссии на марс 94/96.Adv. Space Res. 18(1/2), 323, 332.
M.C. Krebsa, P. Becassea, Verjatb, J.C. Darborda.b.
Лаборатория микробиологии, Университет им. Рене Декарта, 4 Avenue de l’Observatoir, F75006 Париж, Франция.
Лаборатория биологического контроля, Центральная аптека госпиталей, 7 rue du Fer à Moulin, F75005, Париж, Франция