Устойчивые к глютаральдегиду бактерии

Бактерии, устойчивые к глютаральдегиду и другим альдегидам, связанные с использованием моек-дезинфекторов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ 

История вопроса

Бактерии широко описаны в литературе как адаптирующиеся и устойчивые к особому антимикробному воздействию антибиотиков. Они могут также проявлять временную или постоянную устойчивость к различным биоцидам, применяемым в антисептиках и дезинфицирующих растворах. Атипичная микобактерия широко распространена и проявляет целый ряд механизмов сопротивляемости. Недавняя вспышка Mycobacterium massilience и M. abcessus была связана с развитием резистентности к  глютаральдегиду.

Цель

Протестировать последнюю промывочную воду в химических мойках-дезинфекторах и проанализировать механизмы сопротивляемости изолятов после дезинфекции.

Методы

Образцы последней промывочной воды и поверхности (смыва) были обработаны из моек-дезинфекторов с использованием альдегидов для дезинфекции. Методы выращивания применялись для изолирования мезофильных бактерий и атипичных микобактерий. Все изоляты были идентифицированы с помощью жирной кислоты и анализа 16S rRNA. Изучение профилей устойчивости изолятов и контрольных образцов к дезинфекции проводилось по времени, требующегося на уничтожение, с помощью альдегидных дезинфицирующих растворов. Изоляты, продемонстрировавшие устойчивость, подвергались дальнейшему анализу профилей роста, клеточной оболочки и генетическому анализу.

Результаты

Результаты подтверждают, что изоляты Mycobacterium могут проявлять значительную устойчивость к дезинфицирующим концентратам альдегидов, но при этом не была обнаружена перекрестная резистентность к другим неальдегидным биоцидам. Анализ клеточной оболочки говорит о том, что некоторые из этих штаммов имеют меньше гликопептидолипида в клеточной оболочке, чем чувствительные линии (штаммы). Анализ изолятов из новой мойки-дезинфектора из данного исследования показал, что целый ряд изолятов бактерий может быть идентифицирован как постобработанные. Они включают в себя атипичные микобактерии (M. abcessus, M. chelonae и M. gordonae) и Methylobacterium, которые были ранее замешаны в условно-патогенных и псевдо-вспышках инфекции. 

Заключение

Результаты данного исследования подчеркивают важность развития устойчивости к биоцидам, в частности, в среде мойки-дезинфектора. Устойчивость к альдегидам требует особого внимания и осуществления контроля в применении к мойке-дезинфектору.

ВВЕДЕНИЕ   

Развитие устойчивости к антибиотикам и другим антибактериальным средствам в микроорганизмах – важный вопрос в контроле инфекции. Менее изученные, микроорганизмы могут также проявлять временную или постоянную сопротивляемость различным биоцидам, применяемым в антисептиках и дезинфицирующих растворах. Например, была выявлена значительная сопротивляемость в бактериях по отношению к глютаральдегиду, одному из наиболее распространенных биоцидов, применяемых для низкотемпературной дезинфекции/стерилизации. Это и подобные заключения связаны с бактериями, изолированными от мойки-дезинфектора с использованием  глютаральдегида во время изучения инфекций и псевдо-инфекций. В частности, изоляты Mycobacterium и Methylobacterium полностью устойчивы к действию глютаральдегида при нормальных условиях дезинфекции. Недавняя вспышка Mycobacterium massiliense и  M. abcessus в Бразилии демонстрирует похожее явление.

В данном отчете проведены испытания трех моек-дезинфекторов для высокоуровневой дезинфекции, использующих альдегиды (глютаральдегид или ОПА) в соответствии со стандартными циклами переработки. Образцы промывочной воды и смыва были проанализированы на микробную контаминацию, установление биологического вида и характеристик устойчивости. Параллельно, один глютаральдегид-устойчивый изолят был исследован генетически и биохимически для понимания механизмов устойчивости к альдегидам. 

Табл. 1. Бактериальные штаммы, обнаруженные в мойке-дезинфекторе 

МЕТОДЫ

Три мойки-дезинфектора, применяемых для очистки и высокоуровневой дезинфекции гибких эндоскопов, были протестированы на различных участках в США. На двух применялся ~2,5 % глютаральдегид (при температурах 24С и 35С соответственно), и на одном 0,55% ОПА (при 25С). Образцы последней воды для полоскания (200 мл) и поверхности (смыва) (минимум 10 участков в каждой мойке) были собраны в точном соответствии со стандартным циклом переработки. Все образцы были выращены на TSA/R2A при 30С (мезофильные бактерии) и 7H11 агаре при 30С (атипичные микобактерии), рост анализировался на 7 и 14 день инкубации. Удачно пересеянные изоляты определялись микробным анализом Sherlock DNA (последовательность 16 rRNA) и с помощью системы микробного анализа Sherlock (анализ с помощью жирной кислоты; MIDI Inc.).

Для изучения чувствительности к биоцидам, 1 мл каждого тестового организма был смешан с 9 мл ~2,5% глютаральдегида или 0,55% ОПА при 25С в течение требуемого времени воздействия. 1 мл образцов, взятых по истечению времени воздействия, был нейтрализован, профильтрован и подсчитан по листам (по TSA, R2A 7H11 агара, в зависимости от тестового организма).   Mycobacterium gordonae использовалась как референтный штамм. 

Один стабильный глютаральдегид-устойчивый изолят Mycobacterium chelonae изучался для выяснения механизмов сопротивляемости и воздействия на восприимчивость к антибиотикам. Были проведены эксперименты по поглощению питательного вещества ([U-14C] глюкозы), как было описано ранее. MIC (минимальные дозы ингибитора) антибиотиков были определены, как ранее описывалось, по устойчивому изоляту и контролю немутантного типа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Микробная контаминация была обнаружена во всех мойках-дезинфекторах непосредственно после дезинфекции. Предварительный анализ обнаружил целый ряд грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая микобактерии, грамположитнльные кокки и псевдомонады. Во многих случаях попытки пересеять эти изоляты не были успешными. К настоящему времени был установлен ряд успешно пересеянных изолятов (табл.1). Они, в частности, включают в себя разновидности Mycobacterium и Methylobacterium, многие из которых были найдены в воде.

Анализ полученных результатов дает основание предполагать два основных источника этих изолятов в мойках-дезинфекторах: выживаемость бактерий во время воздействия высокоуровневой дезинфекции (например, благодаря образованию биопленки или развитию сопротивляемости) или перекрестная контаминация во время полоскания. Было замечено, что все протестированные мойки-дезинфекторы предоставляли возможность перекрестной контаминации за счет систем доставки воды для полоскания в камеры для дезинфекции. Все изоляты из таблицы 1 были протестированы на чувствительность к глютаральдегиду и ОПА (примеры приведены на графике 1).  В одном устройстве все изоляты были чувствительны к альдегидам, за исключением изолята Bacillus megaterium, который был протестирован в вегетативных (неспороносных) условиях; в этом случае предполагается перекрестная контаминация. В устройстве, в котором применялся ОПА, у одного штамма (M. gordonae) наблюдался рост устойчивости к глютаральдегиду и ОПА, у двух штаммов (M. avium и P. aginolyticus)- рост устойчивости к ОПА; эти результаты убедительно говорят о выживаемости штаммов во время дезинфекции. Наконец, в одном устройстве (в котором применялся глютаральдегид) была обнаружена совокупность штаммов, как чувствительных, так и устойчивых (например, Mycobacterium abscessus/ chelonae) к альдегидам.

Эксперименты с рядом мутирующих Mycobacterium smegmatis в различных компонентах клеточной оболочки говорят о том, что штаммы с недостаточным проявлением порина (например, mspA и mspA/mspC) проявляют возросшую устойчивость к альдегидам. Для проверки данной гипотезы на изолятах из окружающей среды, был исследован стабильный альдегин-устойчивый изолят Mycobacterium chelonae. Было отмечено, что дальнейший пересев широкого ряда ранее идентифицированных устойчивых штаммов не был стабильным и возвращался в наших исследованиях к состоянию альдегин-чувствительности; поэтому этот стабильный штамм был выбран для дальнейшего анализа. Анализ секвенирования ДНК области с закодированным скоплением порина в устойчивом изоляте выявил сдвиг рамки генетического кода, что приводит к прогнозируемому  аминокислотному удалению последующего белка порина. Кроме того, исследования поглощения питательных веществ (глюкозы) и значительно более медленный уровень роста этой мутации по сравнению с немутантным типом давали основания полагать, что связанные с порином мутации прочно связаны с устойчивостью к альдегидам у микобактерий. Этот и другие потенциальные механизмы устойчивости остаются предметом дальнейшего изучения.

Этот устойчивый изолят показывал нормальную чувствительность к антибиотикам, за исключением значительно возросшей (5-ти и до более, чем 100-кратной) устойчивостью к крупным и/или гидрофобным антибиотикам, таким как рифампицин, ванкомицин, ципрофлоксацин, кларитромицин и эритромицин. Их размер подвергает сомнению, что возросшая устойчивость связана с менее эффективным поглощением через порины. Более вероятно, что это произошло из-за реорганизации внешней мембраны в этих штаммах, что вызвало снижение пассивной диффузии. Интересно, что штамм был также был от 4-х до более, чем 10-крат более устойчивым к линезолиду и тетрациклину.

  

ВЫВОДЫ

• Конструкции некоторых моек-дезинфекторов могут служить источником перекрестной контаминации; 
• Контаминация может быть вызвана водой для полоскания, в частности, где не была проведена стандартная санобработка воды для полоскания, включая мойку-дезинфектор;  
• Контаминация может быть вызвана наличием биопленки и/или развитием устойчивости к альдегидам, даже при нормальных условиях эксплуатации;
• Были выделены бактериальные штаммы, толерантные к глютаральдегиду и ОПА; 
• Биохимический и генетический анализ дают основание полагать, что мутации в проявлении гена порина могут вызывать развитие устойчивости; 
• Результаты данного исследования подчеркивают важность развития устойчивости к биоцидам и, в частности, в среде моек-дезинфекторов. Альдегин-устойчивость является предметом особого внимания и должна находиться под контролем в применении к мойкам-дезинфекторам. 

SHEA 19th Annual Scientific Meeting, San Diego, CA, USA. March 19-22, 2009.